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          H1N1流感病毒整体解决方案
          发表日期:2012-06-26
           

          一.病毒RNA样品提取

           Real-time RT-PCR实验的第一步是获得纯净的RNA样品,检测H1N1病毒的呼吸道样本包括支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物、痰、鼻咽或口咽洗液或拭子。而在流行病爆发时,能够对大批样品进行快速而安全的提取非常重要。ThermoFisher公司的KingFisher系列自动化磁珠提取纯化仪器,联合Ambion等公司的病毒RNA磁珠提取试剂盒,可以用于从多种来源的样本中,如血清、血浆、口腔拭子和细胞培养液中,提取病毒RNA。该系统不需有机溶剂或RNA沉淀步骤,消除了基于滤膜的方法经常碰到的问题,如滤膜堵塞、大的洗脱体积和不稳定的产率。KingFisher可以让操作人员免去很多繁琐的手工操作,并且远离病毒及有毒试剂的危害。而结合后续的实时定量RT-PCR,可仪检测到低至10拷贝的病毒RNA,可极大提高H1N1亚型猪流感病毒检测的灵敏度。

              此技术经过美国国家兽医服务实验室(NVSL)验证,是美国农业部认可的禽流感检测的分子生物学方法。目前,日本的国立传染病研究所刚刚购买了4台新推出的Kingfisher Flex,应用于流感病毒RNA的纯化。韩国的Catholic University 也刚刚采购了Kingfisher mL用于病毒RNA的应用。越南的Kingfisher安装在世卫组织(WHO)的实验室。中国农业部兽医诊断中心、哈兽研动物流感参考实验室、北京出入境检验检疫局 等单位,以及澳大利亚和新西兰的Kingfisher系统也主要应用于这方面的工作。

           

           

           

           

           

           

           

          Kingfisher磁珠纯化家族

           

           

           

           

           

           

           

           

           

           

           

           

           

           


          二.Real-time RT-PCR检测

           Real-time RT-PCR是目前最快速最灵敏的病毒检测方法之一,也是《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》中推荐使用的方法。Real-time RT-PCR检测猪流感的方案是用一组寡聚核苷酸引物和Taqman探针,对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计,swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒,swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。因为实验材料是RNA,所以推荐使用一步法反转录荧光定量PCR试剂盒。

          美国Bio-Rad作为全球分子生物学实验室设备领域的领先者,对于流行病致病菌和病毒的检测一直非常关注。美国CDC/WHO 关于猪流感检测的文献和操作方法中,使用了Bio-Rad的一步法荧光定量PCR试剂盒iScript One-Step RT-PCR Kit,及Bio-Rad的荧光定量PCR仪。

          美国Bio-Rad的CFX96 实时定量PCR仪,能够为使用者提供可靠的温度控制特性、最先进的光学检测技术和功能强大的软件控制及数据分析能力,能够得到精确的定量结果,准确区分目标基因。为研究者提供最佳的实时定量PCR结果。

           

          CFX96 Touch实时定量PCR仪的主要特点

                 

           n      结果可靠——光源和检测器采用一体化的光梭,长寿命的LED和光敏二极管整合在一起,确保实验结果可靠;                           

          n        快速得到实验结果——光学系统出厂时即经过严格校正,

          仪器即插即用,能够在数分钟内完成安装,开始实验

          n        缩短实验运行时间——快速的升降温速度,

          能够在30分钟内完成定量PCR 实验

          n        快速优化实验条件——温度梯度功能能够在一次实验中既能找到最优化的实验条件

          n        减少实验样品和试剂的消耗——10 μl反应体系即能得到稳定可靠的实验结果

          n        根据实验需要选择数据采集方法——支持SYBR Green 快速扫描模式

          n        随时随地分析实验结果——软件能自动通过电子邮件将实验结果作为附件发送

          n        提高检测通道——一台电脑能够控制多大4台CFX96 Touch 实时定量PCR 仪

           

           

           

           

           

           

          美国Bio-Rad的一步法荧光定量PCR试剂盒iScript One-Step RT-PCR Kit,融合了iScript反转录酶系统和iTaq热启动DNA聚合酶系统,非常适用于病毒的快速检测,是美国CDC2007年推荐的检测猪流感的标准Protocol中采用的试剂盒。

          iScript One-Step RT-PCR Kit的主要特点:

          n        可兼容所有杂交探针进行灵敏和特异性的RT-PCR

          n        线形动态范围从100fg到100ug,使客户的实验设计

          具备很大的灵活性,可靠检测低拷贝的目标序列。

          n        整个试剂盒只有优化过的三管成分,操作简便。

          流水线化的反应组装程序,有效减少实验操作和试剂分装步骤中引入交叉污染的几率。

          n        独特的低起泡配方,减少加样过程中带来的气泡,使高通量和自动化实验中的组装步骤变简单。

          n        经验证,可对样品中拷贝数接近的两个目标序列进行同时检测。

           

          三.样品操作与保存

          《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》中要求样品处理要在生物安全实验室完成。生物安全实验室需要配备相应的生物安全柜对实验室环境、操作人员及样品进行保护。美国热电 Thermo Fisher旗下的 A2/B2型生物安全柜是世界上最好的生物安全柜,在国际上享有很好的盛誉。美国热电的生物安全柜(包括部分棑和全棑)都,达到Class 2等级,工作区气流洁净度达100级。此外,同属Thermo Fisher旗下的Forma系列-80℃超低温冰箱能够为样品提供最好的保存环境与保护,Forma系列液氮罐更可以用于有生物危险性的样品的运输。

           

           

           

           


          猪流感实验室装备设备

           

          一、生物防护设备

          设备名称

          技术规格

          数量

          单价

          推荐品牌

          备注

          100%排

          二级生物安全柜

          用途:生物安全操作的平台

          B2型 (100%外排)

          1、※ 通过美国NSF/ANSI49安全标准,列入UL.

          2、※采用双风机和直流无碳刷电机驱动。

          3、※ 主动气流调控模式,不用调节阀门即可自动调节气流,对操作者更安全。

          4、UV灯可编程定时,自动熄灭;定时范围从0小时到24小时。

          5、高效HEPA过滤器,针对0.3um颗粒,过滤效率高于99.999%。

          6、内部工作区域(W×H×D)mm:≥1232×742×648

          配置:

          1、主机(含双HEPA过滤器和双风机) 1台

          2、可调高度支架 1台

          3、搭手架  1套

          4、紫外灯管  1支

          5、外排管道和风机  1套

          3-4台

          13万

          美国Thermo

           1316型

          要求原装进口

          WHO推荐

           

          30%外排

          二级生物安全柜

          用途:生物安全操作的平台

          A2型 (30%外排,70%循环)

          1、※ 通过美国NSF/ANSI49安全标准,列入UL.

          2、※采用双风机和直流无碳刷电机驱动。

          3、※ 主动气流调控模式,不用调节阀门即可自动调节气流,对操作者更安全。

          4、UV灯可编程定时,自动熄灭;定时范围从0小时到24小时。

          5、高效HEPA过滤器,针对0.3um颗粒,过滤效率高于99.999%。

          6、内部工作区域(W×H×D)mm:≥1200×780×495

          配置:

          1、主机(含双HEPA过滤器和双风机) 1台

          2、可调高度支架 1台

          3、搭手架  1套

          4、紫外灯管  1支

          2-3台

          7.5万

          美国Thermo

           1356型

          要求原装进口

          WHO推荐

           

          防护设备

           

           

           

          3M

           

           

          二、样品提取和检测设备

          设备名称

          技术规格

          数量

          单价

          推荐品牌

          备注

          磁珠核酸纯化分选系统

          用途:特殊设计的分离提取核酸、蛋白及细胞的自动化系统

          1、※ 专利的KingFisher技术,通过转移磁珠的方式来转移样品,绝无交叉污染。使用安全和高质量的结果。

          2、每纯化15个样品只需15-30分钟

          3、※ 开放的试剂平台,适用于所有国外和国内试剂

          4、处理样品体积:50-1000uL

          5、磁珠收集效率:>95%

          配置:

          1:KingFisher ml主机

          2:程序BindIt软件

          3:KingFisher ml tip comb  磁套  800个

          1-2台

          24万

          美国Thermo

          KingFisher ml型

          要求进口

           

          流感病毒RNA的纯化(美国农业部指定检测禽流感设备)

          高通量

          全自动磁珠分选系统

          KingFisher Flex型高通量全自动磁珠分选系统

          (特殊设计的分离核酸、蛋白及细胞的自动化系统)

          1.※ 所有的纯化和处理步骤均在同一微孔板(管)中进行。每纯化96个样品只需15分钟。

          2.※ 转移磁珠,而非溶液,使用安全和高质量的结果

          3.工作容量:96个样品/次

          4.处理体积:20–1000 μl

          5.收集效率:> 95%

          6.磁棒类型:一体化96根磁棒,磁头可更换

          7.板类型:96孔深孔板,96孔PCR板,96孔KingFisher板

          8.磁珠最适尺寸:0.8-10um

          9.预先设定的优化的纯化程序,100个内置程序

          10.能与自动液体处理系统和机械臂兼容,实现自动化操作。

          1台

          68万

          美国Thermo

          KingFisher Flex型

          要求进口

           

          流感病毒RNA的纯化(美国农业部指定检测禽流感设备)

          RNA提取试剂

          病毒RNA磁珠提取试剂盒

          MagMAX?-96 Viral RNA Isolation Kit

          一批

           

          美国Ambion

          配合ThermoFisher磁珠纯化系统使用

           

          定量PCR仪

          基因定量扩增仪

          型号:CFX96 Touch型

           

          激发光源:6个 LED

          检测器:6个PDT

          动力学线性范围:10个数量级

          灵敏度:能检测单拷贝模板

          检测系统特点:光路相对固定;各通道独立检测,避免通道间的干扰;96孔逐孔扫描,避免孔间干扰。 

          升降温速率  5 ℃/秒

          温度范围:0 - 100℃

          准确性:±0.2℃

          均一性:±0.4 ℃

          温度梯度功能选择范围:30-100℃

          温度梯度范围  1 - 24℃

          1台

          60万

          美国Bio-Rad CFX96Touch型

           

           

          定量试剂及耗材

          1.iScript? One- Step RT-PCR Kit 一步法定量RT-PCR试剂盒

          可使用RNA通过荧光定量PCR方法快速检测出病毒含量及基因表达量

          2.PCR反应管、8联管、96孔板等。

          一批

           

          美国Bio-Rad

          美国CDC2007年推荐的检测猪流感的标准Protocol中采用了该试剂盒iScript one step RT-PCR   kit

           

          梯度PCR仪

          用途:病毒DNA扩增

          基因扩增仪

          型号:S1000型

           

          1、加热速率:5℃/sec

          2、温度范围:0-100℃

          3、梯度温控范围:30-100℃

          3、梯度温差范围:1-24℃

          4.在线可储存多于1000个反应程序文件

          5.样品载量:96×0.2ml

          1套

          8万

          美国Bio-Rad S1000型

           

          要求原装进口

           

          全自动电泳

          用途:快速基因检测

          蛋白检测范围:10-260KD

          RNA检测范围:100-6000bases

          DNA检测范围蛋白检测灵敏度:2.5ng/ul (CAII)

          总RNA检测灵敏度:5ng/ul(标),100pg/ul(高)

          mRNA检测灵敏度:25ng/ul(标),200pg/ul(高)

          DNA检测灵敏度:0.1ng/ul

          1台

          30万

          美国Bio-Rad Experion型

          DNA、RNA、蛋白检测

          凝胶成像仪

          用途:用于核酸凝胶的成像

          1、灵敏度:0.1ng EB染色的DNA

          2、动力学范围>3个数量级

          3、最大胶面积:25 x 26 cm, 适合各种尺寸的凝胶。

          配置:

          1、  凝胶成像主机 1台

          2、  白光转换屏 1块

          1台

          13万

          美国Bio-Rad Gel Doc XR型

           

          全自动酶标仪

          用途:用酶联免疫方法测定物质含量

          1、波长范围:400nm-750nm

          2、※读数范围:0-4.0A

          3、重复性:CV<0.2%

          4、读板速率:5秒/板

          配置:

          1、主机(含:405、450、492、630nm滤光片) 1台

          2、彩色喷墨打印机 1台

          3、彩色可调移液器 2个

          2-3台

          5.6万

          美国Bio-Rad 680酶标仪,  美国Thermo

          Muiltiskan MK3型

          酶免方法检测

          荧光/化学发光分析仪

          用途:鉴于滤光片荧光化学发光法进行核酸蛋白定量

          l        2合1荧光/化学发光分析技术,在同一个程序中可进行二种技术的检测。

          l        最新的高性能、高灵敏度的光学系统,狭窄光束直径1.5mm;检测低至每孔2 fmol的ATP,测量线形范围多至7个数量级以上。

          l        ※ 快速检测功能,检测速度:测定96孔板最低时间为15秒

          l        ※ 加样量从1ul-1000ul, 1ul增量,很小的管内死体积

          l        ※1个内置进样器

          l        标配的圆周振荡器,直径和速率可调,确保有效混匀和加速反应时间。

          l        适用1-384孔板型,也可为特定的板型编程。

          1台

          35万

          美国Thermo

          Fluoroskan Ascent FL型

          荧光/化学发光方法检测

          全自动分液器

          用途:精确快速的分液,配合纯化系统、酶标仪洗板机、荧光化学发光仪、叠板机等使用的自动化设备

          1、板型:6-1536孔板

          2、分液体积:0.5-2500nl

          3、分液速度:3s/10ul, 4s/20ul, 10s/100ul(96孔板)

          4、分液精度:0.5ul: CV≤10%

          1台

          19万

          美国Thermo

          Multidrop Comi/SMART型

          自动化精确快速的分液

          自动洗板机

          用途:与酶标仪配套使用

          1、具有圆周震荡、自动冲洗和预洗功能

          2、快速的双排洗头系统

          3、可自动切换和分液

          3、残液量:平均每板每孔〈1ul

          配置:

          1、主机   1台

           (包括双排16道和双排24道洗头)

          2、2L洗瓶和2L废液瓶各一个

          1台

          9.8万

          美国Thermo

          Wellwash

          AC型

          辅助设备

          快速叠板机

          用途:自动化处理微孔板设备,配合纯化系统、酶标仪洗板机、荧光化学发光仪、叠板机等使用的自动化设备

          1、高通量分液,每小时处理量达300块

          2、板容量:225/150块

          3、符合CE; CSA; UL 认证标准

          1台

          29.8万

          美国Thermo

          RapidStak 2X型

          辅助设备

          小型高速离心机

          (含生物防护转头)

          用途:生物样品的浓缩和制备

          1、※ 最高转速: 14800rpm

          2、※ 最大离心力:21000xg

          3、专利技术的‘ClickSeal’防生物污染转头盖(CAMR认证)

          配置

          1.  主机一台

          2.   24×1.5/2.0ml 防生物污染角转子1套

          ( 同时可以离心过滤管 )

          4-5台

          3.5万

          美国Thermo

          Pico21型

          样品的浓缩和收集

          小型高速离心机

          (含生物防护转头)

          用途:生物样品的浓缩和制备

          1、※ 最高转速: 14800rpm

          2、※ 最大离心力:21000xg

          3、专利技术的‘ClickSeal’防生物污染转头盖(CAMR认证)

          配置

          3.  主机一台

          4.   24×1.5/2.0ml 防生物污染角转子1套

          ( 同时可以离心过滤管 )

          4-5台

          3.5万

          美国Thermo

          Pico21型

          样品的浓缩和收集

          台式冷冻高速离心机

          (含生物防护转头)

          用途:大量生物样品的浓缩和制备

          1、※ 最高转速: 15000rpm

          2、※ 最大离心力:21890 xg

          3、最大容量:  4×100 mL

          4、离心时间控制:0-9小时59分或连续离心

             温度控制:-9~ 40℃

          配置:

          1、 主机 一台

          2、 24×1.5/2.0 ml角转头  1套

          (最大转速/离心力:15000rpm/21890xg)

          3、 6×50 ml角转头  1套

          (最大转速/离心力:8500rpm/10015xg)

          2台

          9.8万

          美国Thermo

          Primo R型

          样品的浓缩和收集

          全能台式高速

          冷冻离心机

          (含生物防护转头)

          用途:满足所有生物样品的浓缩和制备

          1、※ 最高转速: 23300rpm

          2、※ 最大离心力:50377 xg

          3、最大容量:  4×180 mL

          4、加减速控制:9级加速控制/9级减速控制

          5、离心时间控制:0-9小时59分或连续离心

             温度控制:-9~ 40℃

          6、驱动系统:无碳刷免维护电机驱动,采用落地式离心机使用的高性能的“Spindle”驱动系统

          配置:

          1、主机 一台

          2、24х1.5/2.0ml固定角转子 1个

          最高转速/最大离心力: 23300rpm /50377 xg

          3、8×50 ml角转头  1套

          最高转速/最大离心力: 15000rpm /26920g

          (包含6.5ml、16ml离心管适配器各8个)

          4.微孔板转子  1套

          (可放置2×2标准板或2×1深孔板)

          1-2台

          19.8万

          美国Thermo

          Biofuge Stratos型

          样品的浓缩和收集

           

           

           

          三、细胞培养和储存设备

          设备名称

          技术规格

          数量

          单价

          推荐品牌

          备注

          高温灭菌

          CO2培养箱

          用途:生物肿瘤细胞等的培养

          1、※ FDA;SFDA认证

          2、内置独特100%HEPA空气过滤系统,每分钟持续过滤箱内空气

          3、四周直热式;内部容积:184.1L

          4、※ 140度的高温灭菌功能

          配置:

          1、184.1L主机 一台

          2、不锈钢带孔搁板 四块

          3、3升增湿水盘    一个

          4、100%HEPA空气过滤器  1个

          2-3台

          5.5万

          美国Thermo

          371型

          要求原装进口

           

          -86℃超低温冰箱

          (双门双锁安全设计)

          用途:生物样品的保存

          1、※美国FDA颁发的CFG证书;欧洲CE,中国SFDA证

          2、温度范围:-50℃~-86℃

          3、内容积:≥360L

          4、两台1HP密封高效压缩制冷机。

          5、独立双外门

          6、※全自动高低电压补偿:采用Boost/Buck变换器。

          配置:

          主机一台

          (含四内门、加热真空减压阀、单手操作门锁)

          3台

          7万

          美国Thermo

          991型

          要求原装进口

          -196℃液氮储存箱

          用途:生物样品的长期储存

          1、 液氮容量:≥47. L

          2、 静持续(天):120

          3、 材质为真空绝热的轻质铝材构造

          4、 容量:750个2ml冻存管

          主机(含6个提桶)

          3台

          5.5万

          美国Thermo

          CMC8038型

          要求原装进口

           

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